昆山腔形成以后，虽然跻身于四大声腔之列，但直到嘉靖初年，影响还很小，基本上只在苏州府和松江府一带流传。嘉靖初年“有魏良辅者，流寓娄东、鹿城之间”（见沈宠绥《度曲须知 曲运隆衰》）。这里鹿城是今江苏昆山，不是浙江温州，周时地称娄邑属吴国，因吴王曾在这里豢鹿狩猎，故又名鹿城，秦设娄县。因吴王曾在这里豢鹿狩猎，故又名鹿城。当时苏、松两府是全国经济最发达，生活最富庶的地区，当地的戏曲发展已十分繁盛，不仅戏班多，而且官府里经常有戏班呈应，民间的戏曲活动也不少，尤其是唱清曲，最有代表性的则是苏州虎丘的“中秋曲会”，自从十六世纪初期开始一直延续到十八世纪的清代中期，可见当时戏曲有多盛行。史料中最早提到魏良辅的是明代文学家、戏曲作家李开先（1502～1568）的《词谑》中说“昆山陶九官，太仓魏上泉，而周梦谷、滕全拙、朱南川……皆长于歌而劣于弹，魏良辅兼能医……”上泉又作尚泉是魏良辅的字，长期寄居太仓，以演唱民间曲调为职业。这种职业使魏良辅接触到北方和南方的多种曲调，通过比较研究，他对昆山腔曲调平直简单、缺少起伏变化这一状况日渐感到不满，于是和一批艺术上的志同道合者亲密合作，开始了对昆山腔的全面改革。
清初文学家余怀(1617～1696)，字澹心，福建莆田人，在《寄畅园闻歌记》中说：“良辅初习北音，绌于北人王友山，退而缕心南曲，足迹不下楼十年。当是时，南曲率平直无意致，良辅转喉神调，度为新声。”魏良辅熟悉音律，开始是唱北曲，因为比不上北方人王友山，于是转而钻研南曲。他居住在太仓南码头，当地驻军中，有很多人通晓音律，魏良辅常与他们切磋技艺和商讨乐理。这时，他结识了驻地的一位南曲专家、太仓卫百户过云适，常向他请教，每次度曲都要等到过云适认为满意了方肯罢休。他还请教从安徽寿州（今寿县）发配至太仓的善弦索、北曲的戏剧家张野塘。明末人宋直方《琐闻录》有记载“野塘，河北人，以罪发苏州大仓卫，素工弦索……昆山魏良辅者，善南曲，为吴中国工。一日至大仓闻野塘歌，心异之，留听三日夜，大称善，遂与野塘定交。时良辅（年）五十余，有一女亦善歌，诸贵人争求之，不许，至是竟以委野塘。”为了艺术的同好，不顾张野塘劳改犯的身份，把诸贵人争求之的女儿嫁给他，也够惊世骇俗的。
魏良辅在过云适、张野塘等人的协助下，在原来昆山腔的基础上，吸收了当时流行的海盐腔、余姚腔以及江南民歌小调的某些特点，对流传于昆山一带的戏曲唱腔进行加工整理，汇集南方和北方各种曲调的优长之处，同时借鉴江南民歌小调音乐，整合出一种不同以往的新式曲调，将南北曲融合为一体，既可使南曲“收音纯细”，又可使北曲“转无北气”，从而改变了以往那种平直无意韵的呆板唱腔。演唱时注意使歌词的音调与曲调相配合，同时延长字的音节，造成舒缓的节奏，给人以特殊的音乐美感，。形成了一种格调新颖、唱法细腻、以字行腔、舒徐委婉的“水磨腔”， 这就是流传后世的昆腔。它以清唱的形式出现，终于使昆腔在无大锣大鼓烘托的气氛下能够清丽悠远，旋律更加优美。魏良辅善于演唱，但对乐器并不精通，而张野塘是个很有才华的民间音乐家，他充分发挥自己的专长，协助魏良辅将北方曲调吸收到南方的昆曲中来。同时对原来北方曲调的伴奏乐器三弦进行改造，将它与箫、笛、拍板、琵琶、锣鼓等乐器共同用在昆曲的伴奏之中，获得成功。
魏良辅十年“足不下楼”，用十年磨一剑的精神改革昆山腔的具体做法，一是“尽洗乖声”即清除违背音律的“倒字腔”，以达到字正腔圆的艺术效果；二是“调用水磨”即把曲调设计得委婉细腻，像“水磨”的效果那样软绵滑润；三是“拍挨冷板”即制订抒缓的清唱板式，并交给鼓师指挥，使唱腔优美动人。此外，还将昆曲语言改为“中州官话”，因而去除了大范围传播的障碍。他还选定曲笛作为昆曲的主奏乐器，与“水磨腔”珠联璧合。经魏良辅一系列的改良，使昆山腔脱离了里巷歌谣、村坊小曲式的低迷阶段，成为可登大雅之堂的正声。在1550年前后，魏良辅被崇奉为昆山腔唱曲的领导者地位，他的年龄也达到了50来岁。这时候在他身边还聚集了善洞箫的苏州张梅谷，善笛子的昆山谢林泉，培养了优秀歌手张小泉、季敬坡、戴梅川、包郎郎等一批人，形成了一个志同道合的艺术沙龙。
昆曲改革的成功给魏良辅带来了巨大的声誉，被誉为“国工”、“曲圣”，乃至昆腔（南曲）“鼻祖”。他的著作《南词引正》一书，是论述昆腔唱法及南北曲流派的重要文献。这种新式的曲调一经问世，立即以不可抗拒的艺术魅力征服了当时的广大听众。一批民间音乐家纷纷向魏良辅学习昆曲的演唱技法，使得这一优美的曲调很快在周围地区传播开来。
清唱还不是戏剧，真正的戏剧，必须有台上的正式表演。戏曲需要有剧本，才可以在舞台上演出，最早用昆曲形式演出的剧作一般认为是昆山人梁辰鱼（约1521―约1594）的《浣纱记》。据说梁辰鱼曾得到魏良辅的真传，在昆曲演唱上具有很高的造诣，在昆山当地极受尊重，周围地区的歌童、歌女争着上门请他指点演唱技巧，甚至还有人不远千里来向他学习。梁辰鱼的传奇《浣纱记》，取材于春秋时代吴越兴亡的故事。首出《家门》云：“看今古浣纱新记，旧名吴越春秋”，可见此剧系依据名为《吴越春秋》的旧本改编而成。《录鬼簿》著录的元杂剧有《进西施》（关汉卿作）和《越王尝胆》（宫天挺作），剧本已佚。《浣纱记》的情节比史书上的记载和有关的历史传说更加丰富。如开头写范蠡与西施在苎萝西村的溪水边相遇并相爱，西施赠范蠡一缕溪纱作为定情之物。後越国为吴国所败，范蠡以国事为重，劝说西施到吴国去。临别时将溪纱分开，二人各持一半。末尾写灭吴之後二人在太湖舟中成婚，又取出溪纱，一同泛海而去。这些情节有助于塑造范蠡和西施两个富有自我牺牲精神的爱国者的形像。以二人的爱情故事和一缕溪纱贯串全剧始终，也使结构更加完整。梁辰鱼同一些民间乐师合作，对魏良辅改革后的昆曲作了进一步加工，创作出《浣纱记》剧本的同时，作《江东白苎》 、《浣纱》诸曲，用昆曲形式在舞台上演出。
经过魏良辅的改革和梁辰鱼的艺术实践，昆曲的影响越来越大，很快传播到江苏、浙江的广大地区，成为这些地域主要的戏剧形式。当时的文坛盟主王世贞，还为之写下“吴阊白面冶游儿，争唱梁郎雪艳词”的诗句。文人学士，争用昆腔新声撰作传奇，许多原有的传奇作品也纷纷以昆曲形式被搬上舞台，特别是汤显祖的临川四梦。这里有一段插曲。当年汤显祖的剧本《牡丹亭》尚未写完，便不胫而走，昆山的梨园弟子纷纷拿去“朝歌夜舞”。但是很快出现了能不能用昆山腔演唱的问题。依字行腔的昆曲，十分讲究语言。为了保证字正腔圆，还引申出许多常用的装饰腔格式。许多人以昆山腔的尺度衡量它，觉得《牡丹亭》的曲辞不合规律，腔、板绝不分辨，衬词、衬句凑插乖舛，唱起来简直会拗折人们的嗓子。作为江西临川人氏，汤显祖无疑更习惯于用宜黄腔、乐平腔、弋阳腔来创作。看来是由于语言方面的局限，他的剧本很快出现了沈璟、冯梦龙、吕天成、臧懋循、硕园等人的改编本，其中有不少是以方便昆曲演唱为目的而改编的。但是这些改编本都不为汤显祖所承认。汤显祖在给宜黄伶人罗章二的信中明确指出：“《牡丹亭记》要依我原本，其吕家（指吕天成）改的切不可从，虽是增减一二字以便俗唱，却与我原本的意趣大不同了。”其实改编者如沈璟，本身就是曲学大师，也会写传奇，不会偏离原作太远。
到万历年间它的影响已从吴中扩展到江浙各地。昆曲传奇如汪廷纳的《狮吼记》（演绎苏轼好友陈季常怕老婆的故事）、张凤翼的《红拂记》（演绎唐人传奇虬髯客、红拂女和李靖风尘三侠故事）、高濂的《玉簪记》（演绎潘必正、陈妙常爱情故事）等的纷纷问世，加速了昆曲作为一个剧种的形成。万历年间，家庭昆班开始大量涌现。在江南园林中，一个个昆曲舞台一步步被搭建起来。点点滴滴的戏曲元素加入进来。配器从简单到齐备、表演从无到有、行当从少到多、舞台从简陋到富丽堂皇。万历末，昆曲已是“四方歌曲必宗吴门”，并且“声各小变，腔调略同”，形成了众多流派，一跃而居诸腔之首。昆腔传入北京，又迅速取代了继北曲之后盛行于北京的弋阳腔（京腔）。它不仅为士大夫所喜爱，而且也深受群众欢迎，遂逐渐发展成全国性剧种，称为“官腔”，而各地方剧种则被叫做“乱弹”或“杂凋”。
万历时期，著名演员有蒋六、宇四等，著名的昆曲戏班有南京的沈周班，士大夫蓄养的家班有申时行（万历朝多年的首辅）、张岱（著名文学家）等。明末清初，士大夫蓄养家班成风，著名的有阮大铖家班、长洲尤桐家班等。著名戏班有北京的聚和、三也、可娱，南京的兴化。苏州的寒香、凝碧等。除了家班和职业戏班的舞台演出外，民间的清唱活动也十分流行。特别是在苏州一带，明末清初每年的中秋之夜在苏州的虎丘曲会都有清唱聚会。.它的参加人数之多，演唱水平之高，参加者情绪之热烈，可谓空前绝后。李渔写的诗《虎丘千人石上听曲》 ：“一赞一回好，一字一声血，几令善歌人，唱杀虎丘月。”反映了当时的盛况。清唱活动推动了当时整个社会性昆曲演唱的普及和进步，许多清曲家还结合自己的演唱，对昆曲的唱法进行精研和考订，刊印众多昆曲曲谱流传於世。著名如苏州曲家叶堂整理校订的《纳书楹曲谱》，他所记录的叶派唱法，为后代清曲家和专业演员习唱昆曲的经典曲谱。直到晚清，清曲家结社习唱昆曲之风仍在江苏、上海、浙江和北京等地流行。有些清曲家还不时登台演出，其中也有佼佼者下海成了著名的昆剧表演艺术家。昆曲艺术在它的发展过程中，大批既是实践家又是理论家的涌现，也使它全部活动和进展始终伴随著清晰的逻辑表述和理论性指导。
从魏良辅《南词引正》、沈宠绥的《弦索辨讹》和《度曲须知》开始，文人们在从事昆曲活动时都赋予了一定的理论意识，努力把自己的实践活动上升到理性高度。到了明万历年间，以汤显祖和沈璟的出色理论成果和著名“意趣神色”与“词人当行，歌客守腔，大家细把音律讲”的理论对峙为标志，加上潘之恒《鸾啸小品》的表演理论以及胡应麟《少室山房笔丛》，徐复祚《三家村老委谈》，臧懋循《元曲选序文》 ，吕天成《曲品》等论述，使理论水平的构筑有了整体建树。此后又有是中国戏曲史上第一部全面的、系统的、独创性的理论著作：王骥德《曲律》，以及祁彪佳《远山堂剧品》 ，孟称舜《古今名剧合选序》的思考，接连不断。到了清代，中国古代最伟大的戏曲理论家李渔的《闲情偶寄》在昆曲领域应运而生，又出现了昆曲表演理论著作《梨园原》 ，以及其他种种理论著作，从而使昆曲的发展在中国戏剧史上获得了无可匹敌的至高地位,，后世其他剧种众生和发展的影响十分深远，因此它也享有了“百戏之师”之盛誉。它所达到的文化品位在整个中国戏曲史上，至今也是绝无仅有。