关于提高新型冠状病毒核酸阳性检出率以及速度的对策(草稿)
作者：柳涯客
目前，新型冠状病毒的疫情仍然十分严重，截至3月9日，中国确诊病例37288，疑似病例28988，死亡813例。湖北省委书记蒋超良2月8日要求：“两天内检测完武汉所有疑似患者”。而工程院的副院长、中国医学科学院院长王辰院士接受央视《新闻1+1》采访披露：“目前核酸检测的阳性率只有30-50%”。也就是说，同一个临床疑似肺炎病人，检测2-3次才有一次阳性结果。
据我的了解，现时武汉的日均核酸检测能力只有6000/天。从疫情公布以来，疑似病例数和确诊病例每日攀升，要完成湖北省委书记蒋超良2月8日要求只有靠CT检查。那么，有没有可能两天内检测完武汉所有疑似患者？完全可能，但我们需要改进核酸检测的技术和方法。
核酸检测的主要问题是阳性率低和检测速度跟不上。最敏感的核酸检测实时RT-PCR方法大概只能检出5个病毒以上的感染。病毒感染在下呼吸道（包括肺），现在取样主要是咽拭子，少部分病人的痰和肺泡灌洗液。肺泡灌洗液的阳性率最高，但时间长，技术要求高，无法推广。新型冠状病毒感染者以干咳为主，痰少取不到样。
我们需要成立科技攻关小组，做多方面的尝试，攻克核酸检测的技术和方法的限制，在近期集中解决几个重要的问题, 我的分析和对策是：
1. 为了提高阳性检出率，改进取样
1）改进取样方法，采用标准和多个拭子取样点
取样病毒量少是核酸检测阳性率低的关键原因。鼻拭子和咽拭子说白了就是护士拿棉签刮一下鼻和咽送检。另外病程的时间段（早期，中期和危重期), 刮的位置和手法个人不同也是导致30-50%阳性率的原因。提高检出率的核心在于提高病毒取样量。
如果采用标准取样点，固定取样的位置，如口腔9点，12点位等，可以避免护士刮的位置和手法不同所造成的采样差异。另外建议多个拭子取样（2-5个）可以增加病毒数量2-5倍，提高阳性率。
由于鼻腔更接近下呼吸道，因而鼻拭子的阳性率可能好于咽拭子，所以建议改为鼻拭子，可以与咽拭子做比较。
2）改进拭子材料
棉签虽然方便，但取样后不易洗脱病毒，效率受到影响，将来争取用易裂解的材料作拭子, 不洗脱，可以提高病毒的数量。
3）改进取样途径
轻症病人增设洗鼻液，漱口液; 肺炎病人增设血液。显然，肺泡灌洗液不适合轻症病人，那么，洗鼻液和漱口液就值得尝试了。洗鼻的方法如同过敏性鼻炎的洗鼻。洗鼻液和漱口液离心2分钟 (10000RCF) 收集细胞。我觉得洗鼻液的阳性率可能会比鼻拭子高。将来开发病毒吸附剂可能改善富集方法，增加病毒数量。
虽然血液细胞不是病毒最易感的细胞（肺泡细胞是），但肺的血液供应非常丰富。人体器官中心脏、胰脏、肾脏、胃脏、脾脏、肺部、肠道、膀胱在生命活动过程中都会耗氧，心脏不是全身耗氧量最高的器官，肺部器官耗氧最多。因此，如果新型冠状病毒感染到肺，收集肺炎病人的血做核酸检测就十分合理。但是，2020年1月24日发表在Lancet的文章中用了住院肺炎病人的血做核酸检测，阳性率为15%。是不是不值得提倡？在我看来，他们的方法不是最好，可以改进，例如加大血的用量（从80微升加大为240微升），最后洗脱溶液减少（50微升变为10微升），这样的改进可以提高病毒数量15倍。即使是15%阳性率，依然可以作为补充。
4）避免运输和待检过程降解
运输和待检过程长达数小时至2天，期间的病毒RNA降解也是需要考虑的因素，我的对策是：提取RNA 之前采样和病毒灭活由护士进行，然后密封常温运输至检测室，加病毒灭活溶液后能防止病毒RNA降解。
2. 提高新型冠状病毒核酸检测速度
为什么武汉的日均核酸检测能力只有6000/天？限速环节主要在于操作安全等级和核酸提取。我的改进对策有这几个方面：
1）扩大符合要求的生物检测室
新型冠状病毒在中国定为乙类甲管，即国家卫健委应急办主任许树强介绍的“国务院已经将新型冠状病毒感染的肺炎纳入法定的传染病，定为乙类甲管，即乙类传染病按照甲类传染病的预防控制措施进行管理”。但是预防控制可以，核酸检测就不必参照甲类。
2020年1月16日前，即使1月7日新型冠状病毒的基因序列公布后，数家公司在几天内推出检测试剂盒（最快的24小时后出产品）获得快速批准，但中国所有的新型冠状病毒核酸检测都要求送到北京疾控中心（中国CDC）检测，此后虽然下放了权限，但符合P3安全等级的生物实验室数目有限。样品低温运输也很不方便。
美国FDA2月4日前，所有的新型冠状病毒核酸检测都要求送到美国疾控中心（CDC）检测，等待时间为2-5天。FDA2月4日紧急下放检新型冠状病毒测权限到各地区CDC核准授权实验室，加快了检测进程(附1, 2)。但是美国只有12例感染者，没有太大的检测需求。
我的建议：病毒灭活由护士病人采样后迅速进行，然后密封常温运输至“云神山检测室”进行核酸提取。也可以考虑此后逐次降低安全等级，后面的在安全等级稍低的生物试验室进行检测。云神山检测室是我起的名字，大概可以容纳100个检验员，每个人8小时可以提取200个样品的核酸。
2）检验员人数
找不到足够检验员怎么办，武汉有60多家医院，每个医院抽3个人不难。全国已支援万多医务人员，增加支援200个检验员应该可行, 这样就是200人。另一个选择则是招募200个生物研究生或医学本科生（上过生物实验科），培训半天就可以胜任。
3）检测机器数量
一个人和一台机器实时PCR仪8小时大概能人工检测650-1000个样品，样品检测后消毒就行。小型机器人就更快了，每台仪器可做10000个样品/天。
4) 病毒灭活剂 (TRIZOL)
病毒灭活剂 (TRIZOL)的主要成分是苯酚。苯酚的作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白变性，释放核酸物质 (RNA)。由于苯酚不能完全抑制RNA酶活性，TRIzol中还加了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、贝塔巯基乙醇等来抑制内源和外源RNA酶。参见附3, 微量总 RNA 提取试剂盒及方法。
总之，100个检验员15台机器一天就可以人工检测2万个样品, 我觉得200人30台机器一天检测4万样品应该能够实现。
以上是我的关于提高新型冠状病毒核酸阳性检出率和速度的对策，希望转贴或转告。只要有关国家或武汉市领导能够看到并考虑提高新型冠状病毒核酸阳性检出率和速度, 也是我们大洋彼岸华人科学家为战胜新型冠状病毒疫情出的一分力。
2-9-2020
附1：CDC-2019-nCoV-Authorization
附2: 美国FDA紧急授权通知(机器翻译版)
附3: 微量总 RNA 提取试剂盒及方法, 根据Huang C 等(Lancet. 2020 Jan 24) 方法改编
如没有特别兴趣以下附件可以略过
附1. CDC-2019-nCoV-Authorization
Robert R. Redfield, MD
Director
Centers for Disease Control and Prevention 1600 Clifton Rd., MS D-14
Atlanta, GA 30333
Dear Dr. Redfield:
This letter is in response to your request that the Food and Drug Administration (FDA) issue an
Emergency Use Authorization (EUA) for emergency use of the Centers for Disease Control and
Prevention (CDC) 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time Reverse Transcriptase
(RT)-PCR Diagnostic Panel for the presumptive qualitative detection of nucleic acid from the
2019-nCoV in upper and lower respiratory specimens (such as nasopharyngeal or
oropharyngeal swabs, sputum, lower respiratory tract aspirates, bronchoalveolar lavage, and
nasopharyngeal wash/aspirate or nasal aspirate) collected from individuals who meet CDC
criteria for 2019-nCoV testing, pursuant to Section 564 of the Federal Food, Drug, and
Cosmetic Act (the Act) (21 U.S.C. §360bbb-3). Testing is limited to qualified laboratories
designated by CDC and, in the United States, certified under the Clinical Laboratory
Improvement Amendments of 1988 (CLIA), 42 U.S.C. § 263a, to perform high complexity
tests.1
On Feburary 4, 2020, pursuant to Section 564(b)(1)(C) of the Act, the Secretary of the
Department of Health and Human Services (HHS) determined that there is a public health
emergency that has a significant potential to affect national security or the health and security of United States citizens living abroad, and that involves the 2019-nCoV. Pursuant to Section 564 of the Act, and on the basis of such determination, the Secretary of HHS then declared that
circumstances exist justifying the authorization of emergency use of in vitro diagnostics for detection and/or diagnosis of the novel coronavirus (2019-nCoV) subject to the terms of any authorization issued under Section 564(a) of the Act.2
Having concluded that the criteria for issuance of this authorization under Section 564(c) of the
Act are met, I am authorizing the emergency use of the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR
Diagnostic Panel (as described in the scope Section of this letter (Section II)) in individuals who
1 For ease of reference, this letter will refer to “qualified laboratories designated by CDC and, in the United States, certified under the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988 (CLIA), 42 U.S.C. § 263a, to perform high complexity tests” as “authorized laboratories.”
2 U.S. Department of Health and Human Services, Determination of a Public Health Emergency and Declaration that Circumstances Exist Justifying Authorizations Pursuant to Section 564(b) of the Federal Food, Drug, and Cosmetic Act, 21 U.S.C. § 360bbb-3. Feburary 4, 2020